Общее описание метода
Страница 3

Элюция — центрифугированием. Под цилиндрик подставляют пробирку от микроцентрифуги и все вместе устанавливают в пробирку бакет-ротора. Выходящая из цилиндрика жидкость в объеме того же 0,1 мл содержит чистую ДНК — предшественники остаются в гранулах.

2. Фракционирование (разделение) смеси макромолекул не очень значительно различающихся по своим размерам. Например, различных белков. Здесь следует использовать длинные (1-1,5 м) колонки, диаметром не более 1 см и загружать их объемом исходного препарата, составляющем не более 1-2% от объема колонки. Если смесь содержит 2-3 компонента, то их нередко удается разделить полностью — они выходят в виде довольно широких, но не перекрывающихся друг с другом пиков.

Если же смесь состоит из нескольких компонентов, то на хорошее их разделение методом гель-фильтрации рассчитывать не приходится. Ведь все эти компоненты, хотя и с различной скоростью, движутся по колонке одновременно. (Другое дело истинная хроматография. Там на первый план выступает сорбция компонентов на модифицированном материале гранул и каждый из них остается сорбированным внутри гранул до тех пор, пока элюент «принудительно» не извлечет его оттуда.)

Тем не менее, и в этом случае гель-фильтрацию можно использовать для очистки одного из компонентов сложной смеси, если примириться с его довольно значительными потерями. С этой целью смесь, например белков, разгоняют по объему элюента так, что интересующий экспериментатора белок оказывается где-то в середине последовательности не полностью разделившихся пиков разных белков. (Для этого надо подобрать размер пор используемых гранул.) Если нужный белок поддается идентификации, например по ферментативной активности, которая ввиду мягкости способа фракционирования вполне может сохраниться, то можно отобрать узкую область элюента, прилегающую к вершине пика этого белка. Таким образом, хотя и со значительными потерями, иногда удается получить практически чистый белок.

Страницы: 1 2 3