Приготовление растворителя. Для приготовления смеси этилацетат - пиридин - вода 150 см3 этилацетата и 30 см3 пиридина хорошо взбалтывают в делительной воронке вместимостью 500 см3, затем прибавляют к смеси 150 см3 дистиллированной воды и снова хорошо взбалтывают в течение 2 .3 мин. После этого смесь оставляют для расслаивания. Когда верхний слой жидкости станет прозрачным, нижний слой сливают, а верхний используют для хроматографирования. Подобным образом готовят и другие составы растворителей, смешивая органические растворители и воду в соответствующих пропорциях.

Хроматографическое разделение. Установка для хроматографирования представляет собой широкий цилиндр с притертой крышкой. Внутрь цилиндра помещают малый цилиндр, на который ставят чашку с растворителем.

Нарезают 10 .12 полосок хроматографической бумаги размером 3ч45 см. При хроматографировании нижний конец полоски может свободно свисать либо его вырезают в виде "язычка", который вставляют в горлышко колбочки-приемника. На расстоянии 10 .15 см от другого конца полоски отмечают точку старта, на которую наносят определенное количество подготовленного гидролизата. Все отметки, на бумажной полоске делают только графитовым карандашом.

Пробу гидролизата наносят микропипеткой со специальным приспособлением, состоящим из резиновой груши в металлическом кожухе и микровинта с шариком. Если упаривание гидролизата нежелательно, то на бумагу наносят несколько раз в одно и то же место необходимый объем раствора сахара, который рассчитывают исходя из массовой доли PB. После нанесения каждой порции раствора пятно хорошо просушивают. Диаметр нанесенного пятна не должен превышать 5 .6 мм.

Полоски устанавливают в строго вертикальном положении. Конец полоски, на который нанесена проба, загибают в чашку. Пятно пробы должно находиться снаружи чашки ниже ее края не менее чем на 2 см. Второй конец вставляют в колбочку-приемник. Для лучшей идентификации Сахаров в установку помещают также полоску бумаги с нанесенным раствором смеси чистых моносахаридов: галактозы, глюкозы, маннозы, арабинозы, ксилозы. В чашку наливают растворитель и установку герметично закрывают крышкой.

Хроматографирование проводят при температуре 18 .22°С, помещая установку в специальную комнату или шкаф. Разделение осуществляется за 24 .90 ч. Хроматографирование считают законченным тогда, когда на проявленной хроматограмме расстояния между пятнами будут не менее 3 мм.

После окончания разделения Сахаров хроматограммы сушат на воздухе в течение примерно 4 ч до полного удаления растворителя. При сушке хроматограммы перекидывают через стеклянную палочку, укрепленную на двух штативах.

Проявление хроматограмм. Проявителем служит раствор, содержащий 1,66 г фталевой кислоты и 0,92 см3 свежеперегнанного анилина в 100 см3 этанола.

Сухие хроматограммы смачивают равномерно проявителем кратковременным погружением в раствор, отжимают между листами фильтровальной бумаги и немного подсушивают на воздухе. Затем хроматограммы помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до нужной температуры. m Несколько хроматограмм одновременно кладут на ребро так, чтобы они не касались друг друга и стенок шкафа. Проявление ведут при температуре 100 .105°С в течение 5 мин. Аналогичным образом проявляют полоски бумаги с нанесенным раствором смеси чистых Сахаров. При установлении природы Сахаров руководствуются цветом пятен, их относительным расположением и расположением пятен чистых Сахаров.

Фотоколориметрическое определение Сахаров. Из проявленной хроматограммы вырезают участки, соответствующие отдельным сахарам, и разрезают их на узкие полоски. Помещают кусочки хроматограмм в пробирки с пришлифованными пробками и заливают 8 см3 раствора HCI в этаноле. Элюирование ведут в течение 1 ч при комнатной температуре, поместив пробирки в темноту. Через каждые 5 .10 мин пробирки энергично встряхивают.

Элюаты сливают в подготовленные сухие пробирки и фото-метрируют - измеряют оптическую плотность на фотоэлектрическом колориметре при синем светофильтре в кювете толщиной 10 мм или же на спектрофотометре при длине волны 420 нм.

Массу каждого моносахарида определяют по соответствующим градуировочным графикам.

Зная массу сахара в пробе гидролизата, нанесенной на хроматограмме, объем этой пробы, кратность упаривания и общий объем гидролизата, рассчитывают массовую долю, % к абсолютно сухой древесине, соответствующих полисахаридов Р - глюканов, маннанов, галактанов, ксиланов, арабинанов

где Ь - масса моносахарида в пробе гидролизата, мкг; х - объем пробы гидролизата, взятый на хроматографирование, см3; V - общий объем гидролизата, V=500 - или 200 см3; k - коэффициент пересчета моносахаридов на полисахариды, £ = 0,90 для гексозанов и 0,88 для пентозанов; з - кратность упаривания; g - масса абсолютно сухой навески древесины, г.