Методика анализа по второму варианту. Подготавливают прибор к работе, как и в первом варианте, но в эбулиостат кроме 5 см1 раствора А и 5 см3 раствора Б, добавляют, отмеривая пипеткой, определенный объем раствора сахара. В случае темного раствора, содержащего более 0,05% PB, этот объем должен составлять 1 .2 см3, а в случае раствора с массовой долей PB менее 0,05% - 5 см3. Затем к жидкости в эбулиостате добавляют из бюретки такой объем раствора глюкозы концентрацией около 0,1 г/100 см3, чтобы на дотитровывание после 2 мин кипячения потребовалось бы не более 1 см3 этого раствора. Добавляемый объем определяют предварительным анализом. Концентрация добавляемого раствора глюкозы должна быть установлена точно; удобнее всего пользоваться раствором глюкозы, приготовленным для установки титра медно-щелочного раствора,

После перемешивания жидкости эбулиостат с пробкой медленно вставляют в колбу, закрывают его пробкой с бюреткой, в которую налит раствор глюкозы. Через 2 мин с начала пробулькивания пара через жидкость в эбулиостате проводят дотитровывание раствором глюкозы, добавляя его со скоростью одна капля за 6 .7 с до перехода окраски в желтую от одной капли раствора глюкозы, израсходованного на дотитровывание.

Массовую долю PB,%, в гидролизате легкогидролизуемых полисахаридов или в разбавленном нейтрализованном гидролизате трудногидролизуемых полисахаридов сл и сг соответственно рассчитывает по формуле

где T2 - титр медно-щелочного раствора по глюкозе для второго варианта, мг; с.

При фотоколориметрическом методе для обнаружения бесцветных Сахаров на бумаге хроматограмму проявляют - обрабатывают раствором проявителя, дающего с сахарами окрашенные соединения. Количества разделенных моносахаридов приближенно можно определить непосредственно на хроматограмме прямым измерением интенсивности окраски пятен. Однако из-за нестабильности окраски и существенного влияния условий обработки хроматограмм точность этого метода невелика: относительная ошибка измерений достигает 10 .15%. Более точным способом является извлечение окрашенных продуктов из хроматограммы - э л ю и с о в а н и е с последующим фотометрированием полученных растворов - злюатов на фотозлектроколориметре или спектрофотометре.

Для разделения Сахаров применяют специальную хроматографическую бумагу № 1 или Ne 2, которую нарезают полосками. Скорость разделения больше на полоске бумаги с продольным расположением волокон, чем на полоске с поперечным расположением. Иногда для лучшего разделения Сахаров необходимо обеспечить более медленное движение растворителя. С этой целью бумагу нарезают в направлении, перпендикулярном направлению волокон.

Хроматографирование осуществляют нисходящим или восходящим потоками жидкости. В первом случае бумагу подвешивают, укрепляя верхний конец в сосуде с растворителем. Во втором случае бумагу помещают в растворитель нижним концом. Когда сахара трудно разделяются, рекомендуется повторное хроматографирование.

Растворитель должен обеспечивать максимальное различие в значениях Rt и сам должен быть высокоподвижен. При разделении Сахаров используют, например, следующие системы растворителей: этилацетат - пиридин - вода.,; н-бутанол - уксусная кислота - вода; н-бутанол - ацетон - вода, и др. Разделение Сахаров зависит от состава растворителя.

Для повышения эффективности разделения растворителю дают возможность стекать до тех пор, пока сахара не разделятся по всей длине хроматограммы. При этом вычислить значения R1 невозможно, так как неизвестен путь, пройденный фронтом растворителя. В этом случае подвижность определяют косвенным способом, сравнивая пути, пройденные разделяемыми веществами, с перемещением пятна вещества с известным Rj. В химии углеводов часто используют ксилозу и определяют коэффициент подвижности Rkc как отношение расстояния, пройденного сахаром, к расстоянию, пройденному в этих же условиях ксилозой. Кроме природы сахара и состава растворителя на коэффициент подвижности влияют качество бумаги и температура среды.

В качестве проявителей применяют разнообразные реагенты в зависимости, от состава разделяемых смесей. Для проявления хроматограмм гидролизатов растительных тканей, содержащих редуцирующие сахара, одним из лучших проявителей считают раствор анилинфталата в этаноле. При проявлении анилинфталатом пентозы в зависимости от количества дают окраску от розовой до темно-красной, гексозы - зеленовато-коричневую, рамноза - светло-коричневую. Для элюирования окрашенных соединений из хроматограммы используют ледяную уксусную кислоту или раствор соляной кислоты в этаноле.

Методика анализа. Разделение Сахаров проводят нисходящим способом при непрерывном протекании растворителя по бумаге.

Подготовка гидролизата. Концентрация PB в гидролизате, подготовленном для хроматографирования, должна находиться в пределах 1 .3%. При необходимости гидролизат упаривают. Упаривание проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50 .60°С или при нагревании на водяной бане в фарфоровой чашке или в стеклянном стакане. Гидролизат легкогидролизуемых полисахаридов предварительно нейтрализуют концентрированным раствором гидроксида натрия до слабощелочной реакции и подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5, затем упаривают и фильтруют через простую конусообразную воронку с бумажным фильтром. Гидролизат трудногидролизуемых полисахаридов нейтрализуют карбонатом бария и отфильтровывают осадок сульфата бария. Полученный фильтрат сразу подвергают хроматографированию. При необходимости производят упаривание после подкисления уксусной кислотой до рН 5 и снова фильтруют. Кратность упаривания точно определяют и учитывают при расчете масс моносахаридов.