Экспериментальное определение первичной структуры белка
Дипломы, курсовые и прочее / Пептиды и первичная структура белка / Дипломы, курсовые и прочее / Пептиды и первичная структура белка / Экспериментальное определение первичной структуры белка Экспериментальное определение первичной структуры белка
Страница 1

Рассмотрим, как можно определить последовательность аминокислот в коротком пептиде. Допустим, что пептид состоит из 6 аминокислотных остатков, расположенных в следующей последовательности:

Ala-Cly-Asp-Phe-Arg-Gly.

(Для обозначения аминокислот использованы общепринятые сокращения). Прежде всего необходимо определить аминокислотный состав пептида. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагреванием до 110°С в течение 24 ч в 6 н. НС1. Далее аминокислоты полученного гидролиза разделяют методом ионообменной хроматографии на колонке с сульфонированным полистиролом. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином: α-аминокислоты дают с нигидрином интенсивное синее окрашивание, а иминокислоты, например пролин, желтое[5].

Рис. 17 нингидрин и флуорескамин

Метод ионообменной хроматографии обладает высокой чувствительностью:

рН 3,25 0,2 м Цитрат натрия

рН 4,25 0(2 м Цитрат натрия

рН 5,28 0,35 м Цитрат натрия

Рис.18 Элюция из колонки

С его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т.е. примерно столько, сколько содержится в одном отпечатке пальца. Количество аминокислоты пропорционально оптической плотности раствора после нагревания с нингидринйм. Если требуется определить еще меньшие количества аминокислоты- порядка нескольких нанограммов, то используют флуорескамин, который реагирует с α-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение. О природе аминокислоты судят по объему элюции, т.е. по объему буфера, использованному для вымывания данной аминокислоты с колонки (рис. ). Сравнение результатов хроматографии гидролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептид имеет следующий аминокислотный состав:

(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe).

Скобки показывают, что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде.

Рис.19 Определение N-концевого остатка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реактив Сэнгера) и затем гидролизуют. ДНФ-производное аминокислоты (в приведенном примере ДНФ-аланин) идентифицируют по хроматографиче-ским характеристикам.

Для определения в белке или пептиде концевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную ковалентную связь с азотом аминогруппы (рис. 20).

Рис. 20 фтординитробензол и дансилхлорид

Впервые для этой цели Сэнгер использовал фтординитробензол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной a-NH2-группой с образованием динитрофенильного (ДНФ) производного пептида желтого цвета. Связь между ДНФ и концевой аминогруппой стабильна в условиях, используемых для гидролиза пептидных связей. Поэтому при гидролизе ДНФ-производного пептида Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly в 6 н. НСl высвобождается ДНФ-аминокислота, которую можно идентифицировать хроматографически как ДНФ-аланин.

Для идентификации N-концевых аминокислот в настоящее время часто используют дансилхлорид, который при взаимодействии с аминогруппой дает стабильное, интенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод позволяет выявить N-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных

связей), присутствующую в таком незначительном количестве, как несколько нанограммов.

При всех достоинствах методов определения N-концевых аминокислотных остатков с помощью ДНФ или лансилхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому же пептиду, поскольку последний полностью распадается при кислотном гидролизе. Пьеру Эдману (P. Edman) удалось разработать метод маркирования N-концевого остатка и отщепления его от пептида без сопутствующего расщепления остальных пептидных связей. Деградация по Эдману (реакция Эдмана) состоит в ступенчатом (по одному) отщеплении аминокислотных остатков с аминоконца пептида, Фенилизотиоциа-нат реагирует с незаряженной концевой аминогруппой пептида с образованием фенилтиокарбамоильного производного

Страницы: 1 2 3

Смотрите также

Кинетика химических реакций
Одна из особенностей химических реакций заключается в том, что они протекают во времени. Одни реакции протекают медленно, месяцами, как, например, коррозия железа. Другие заканчиваются очень быстро ...

Органические соединения.
Органическими называются соединения углерода. Простейшими по составу органическими соединениями являются углеводороды, соединения, в состав которых входят углерод и водород. В молекулах органич ...

Характеристика кобальта
Кобальт (лат. Cobaltum), Со, Название металла произошло от немецкого Kobold - домовой, гном. Соединения кобальта были известны и применялись в глубокой древности. Сохранился египетский с ...