лецитин + Н2Про холин + фосфористая кислота, (4)

холин + ПРО2 + 2Н2Про бетаин + 2Н2ПРО2 , (5)

где: ChOx -фермент холиноксидаза.

Иммобилизация ферментов необходима для того, чтобы увеличить стабильность измерений, сделать более эффективную связь ферментативной реакции с преобразователем, локализировать реакцию в одном сенсоре, сделать возможными непрерывные измерения и доступным их математический анализ.

Иммобилизацию ферментов проводят ионообменом или ковалентным связыванием, поперечной сшивкой (сетка) или удерживанием в ловушках (молекулярные решетки, микроинкапсуляция). Ковалентное связывание наиболее эффективно из всех методов сохранения активности и увеличения долговечности ферментов. Достаточно важным является и связывание фермента с мембраной через соответствующие функциональные группировки. Локализация ферментативной реакции - также один из наиболее важных моментов в технологии создания сенсоров. Появилась возможность локализовать ферментативную реакцию там, где это наиболее выгодно: на мембране или непосредственно на электроде, где прямая реакция протекает без диффузионных ограничений. Возможность непрерывных измерений обеспечивается отсутствием необходимости замены фермента, в котором можно регенерировать после окончании реакции. Содержание ферментов в гелях достаточно детально описано для ферментов, встроенных в агарозу. Ферменты специфическим образом познают субстрат, косубстрат, кофактор, активатор и ингибитор. Ферменты способны осуществлять множество превращений с одинаковой эффективностью. Действие ферментов может приводить к мощному увеличению сигнала, который регистрируется. Ферменты могут быть иммобилизированы.

К резистометрическим сенсорам относят биосенсоры, в которых информационный сигнал пропорционален активной составляющей электрохимического импеданса Z на высокой частоте f. При высоких f комплексная диаграмма Арганда вырождается в точку на действительной оси импеданса Re Z и практически равняется сопротивлению раствора Rр. На рисунке 3 приведена схема тонкопленочного резистометрического биосенсора, использованного в работе [7], для определения глюкозы и мочевины путем измерения проводимости G в крови при частоте переменного тока f = 10 кГц.

Рисунок 3. Схема измерения проводимости тонкопленочного биосенсора, где I - рабочий электрод, II - электрод сравнения.

В ходе эксперимента авторы измеряли зависимость амплитуды исходного сигнала от концентрации субстрата. Для создания биоматрицы готовили растворы фермента и БСА в 20 мм калий-фосфатном буфере с рH=7,4 с конечными концентрациями 50-100 мг/моль и смешивали в соотношении 1:1, соответственно. Каплю смеси "фермент + БСА" наносили на поверхность одной пары электродов. На поверхность второй пары наносили раствор чистого БСА (электрод сравнения). Для полимеризации электроды окунали в атмосферу насыщенных паров глутарового альдегида на 30 мин., потом подсушивали мембраны на воздухе. Сигнал от электрода с мембраной БСА, которая расположена на том же кристалле, вычитался из сигнала на электроде с ферментативной мембраной. Разработанный биосенсор позволил определить глюкозу и мочевину в крови.

Во многих случаях для выявления биологической (в первую очередь, ферментативной) активности бактерий можно использовать амперометрические системы проточного инжекционного анализа и миниатюрные электрохимические детекторы. В этих случаях необходимо использование перистальтического насоса. Повышение скорости омывающего рабочий электрод анализируемого потока раствора приводит к увеличению регистрируемого сигнала [8].