При подготовке ксилемы в первую очередь надо было остановить все процессы происходящие в ней поэтому фиксировали ее. Обработка ксилемы включала два основных этапов. Первое – механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе – экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами.

Удаление пектиновых веществ с мы осуществили с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаление оксалата аммония и пектиновых веществ из нашей колбы мы центрифугируем их 3 раза с водой.

Обработка клеточной стенки ксилемы льна 4% NaOH позволяла извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония, нужен более сильный раствор. Мы применяли 4% NaOH который высвобождает целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем мы снова удаляли щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяли рН универсальной лакмусовой бумажкой, промывали до нейтрального.

Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выподает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяли в » 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждали целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА мы используем так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяли от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензировали в содержащем целлюлазу ацетатном буфере. В течение 1–2 суток фермент растворял осаждённую целлюлозу (Фильтрат 2). Мы получили раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ мы разрушаем все гликозидные связи и при высушивание весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней мы и определяем моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахоров по которым мы и опознаем конкретный моносахар.

В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.