Рис.

Материал полиалмерных и поликарбонатных пробирок плохо смачивается водой. Поэтому подавать жидкость в пробирку по стенке неудобно — она будет скатываться каплями, нарушая плавность градиента. Лучше, как это показано на рисунке, подавать раствор сахарозы через длинную иглу на дно пробирки. В смеситель в этом случае заливают раствор сахарозы минимальной концентрации, а в резервуар — максимальной. Более плотный раствор сахарозы будет плавно оттеснять кверху менее плотные слои.

В некоторых случаях, например, когда желательно, чтобы крупные частицы, приближаясь ко дну пробирки, не только не увеличивали бы скорость своего движения, а, наоборот, уменьшали ее, имеет смысл подобрать нелинейный, круто нарастающий ко дну пробирки градиент концентрации сахарозы. Так, чтобы совместное влияние роста плотности и особенно вязкости среды центрифугирования оказались сильнее, чем эффект увеличения радиуса вращения. Этого можно достигнуть, если диаметр смесителя сделать больше диаметра резервуара. При заполнении пробирки сумма объемов жидкости в обоих стаканах должна быть использована полностью. Сначала небольшие добавки плотной сахарозы из резервуара, разбавляясь в большом объеме жидкости в смесителе, будут лишь незначительно увеличивать начальную плотность раствора. Тем не менее, в конце заполнения пробирки плотность раствора в ней все равно достигнет максимального значения — градиент окажется медленно нарастающим в верхней части пробирки и крутым у ее дна.

Извлечение и определение разделившихся зон после окончания центрифугирования (поскольку они не окрашены) приходится делать «на ощупь». Проще всего, — так оно и делалось поначалу, — закрепив открытую пробирку в зажиме вертикально, проколоть ее дно иглой от шприца и собирать фракции по определенному числу капель в последовательный ряд пробирок, установленных в штативе, который самому экспериментатору и передвигать своевременно. Способ нехорош не только тупой трудоемкостью, но и изменением объема капель по мере опорожнения пробирки. Лучше к игле присоединить тонкую полиэтиленовую трубочку, а ее к перистальтическому насосу (будет описан в следующей главе) с заданной скоростью откачивания жидкости. От насоса подавать выбранное количество капель в пробирки, установленные в «коллектор фракции». Последний представляет из себя механический прибор, где порядка 100-150 пробирок поочередно, автоматически, — через заданные интервалы времени или после отсчета заданного числа капель, подводятся под капельницу, которой заканчивается трубочка, идущая от насоса.

Можно пробирку и не прокалывать, а иглу осторожно опустить сверху до дна пробирки и таким образом пофракционно отсасывать ее содержимое. В любом случае обнаружение разделенных зон осуществляется последовательной проверкой всех пробирок на ультрафиолетовое поглощение: на длине волны 280 тц для белков и 260 тц — для нуклеиновых кислот. Фракции, обнаружившие искомое содержимое, объединяются.

В качестве интересного для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, я выбрал исторические опыты Оказаки (1971 год), положившие основу современным представлениям о механизме редупликации ДНК. В этих опытах бактерии, растущие в жидкой питательной среде, получали через эту среду импульсную метку радиоактивным тимидином длительностью от 2 секунд до 2-х минут (в разных опытах). По окончании импульса бактерии быстро охлаждали, выделяли суммарную ДНК и центрифугировали ее в щелочном (для полной денатурации ДНК) градиенте 5-20% сахарозы в бакет-роторе на скорости 25 тыс. об/мин в течение 16 часов. После раскапывания градиента содержание новосинтезированной ДНК в каждой фракции оценивали по радиоактивности (в жидком сцинтилляторе — см. главу 15).