Актуальность работы.

В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием 2Н (D) и углеродом 13С, которые незаменимы для разнопрофильных биомедицинских и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов.

Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих современных методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы молекулы синтезируемых БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов в последнее время появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии сравнительно дешёвых дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий (О.В. Мосин, Д.А. Складнев). Однако опробированные в лабораторных условиях процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D2O).

Явление адаптации к тяжёлой воде интересно не только с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Вышеперечисленные данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllusflagettatum

,

галофильные бактерии

Halobacterium

halobium

и бациллы

Bacillus

subtilis

и

Bacillus

amyloliquefaciens

.

Настоящая работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программы "Наукоёмкие химические технологии ".

Целью данной работы

была разработка методов биотехнологического получения молекул аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, в рамках работы представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были разработаны специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных молекул БАС на их основе.

Научная новизна работы

заключается в следующих аспектах:

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2. Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных молекул аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных

молекул БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные 13С - аминокислоты (степени изотопного включения в молекулы составляют до 97,5% от общего количества атомов водорода в молекуле), [1,3',4',2,8-D5]-инозин (степень включения дейтерия в молекулу 62,5% от общего количества атомов водорода в молекуле) и дейтерий-меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки в молекулу.

4. Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.