Изучение термо- и рН-стабильности ферментов часто несёт прикладной характер.

Исследование этих характеристик проводится остаточной активностью фермента после выдержки его раствора в течение некоторого времени при определённых рН и температуре [11].

Нами были проведены исследования кинетики кислотной и термической инактивации протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и рассчитаны кинетические параметры этого процесса.

При изучении термо- и рН –стабильности раствор препарата выдерживали в фосфатном буфере в диапазоне рН от 5,0 до 12,0 и температур от 30 до 60оС. Периодически отбирали аликвотные доли раствора и определяли остаточную протеолитическую активность.

Полученные результаты по инактивации обоих ферментов показали, что протеиназа 1 сохраняет активность в широком диапазоне рН. При значении рН 7,0 через 200 часов фермент сохраняет около 90% активности (рис.4). При значениях рН 6,0 – 9,0 активность фермента снижается до 70 – 75%, это указывает на то, что фермент в указанном интервале не подвержен автолизу, а, следовательно, его нативная конформация обладает высокой стабильностью. При значениях рН ниже 6,0 и выше 11,0 каталитическая активность фермента быстро снижается.

Во всех случаях ПА/КлА-const, это свидетельствует о том, что мы имеем дело с одним ферментом.

Термическую инактивацию протеиназ изучали в интервале температур 30 – 60оС. Протеиназа 1 в области высокой рН-стабильности инактивируется почти полностью при температуре 60оС в течение 60 часов, в то время как протеиназа 2 при этой же температуре инактивируется полностью уже за 3 часа. Данные свидетельствуют о высокой термостабильности протеиназы 1. Инактивация протеиназы 2, происходящая при высокой температуре, по-видимому, определяется процессом разворачивания белковой глобулы.

Протеиназа 1, обладающая коллагенолитическим действием, нас интересует с практической точки зрения, поэтому были рассчитаны некоторые кинетические характеристики для этого фермента.

Если предположить, что в каждом элементарном акте процесса инактивации фермента под действием Н+ - ионов участвует одна его молекула, то кислотную инактивацию можно представить в виде реакции первого порядка. Кинетическое уравнение первого порядка имеет вид:

2,303 lg E0/E=K,

где Е0 – исходная активность фермента

Е – активность в момент времени

К – константа скорости инактивации, характеризующая потерю активности в течение часа, час-1.

		Рис. 4. Динамика кислотной инактивации протеиназы I.

Остаточную активность выражали в процентах от исходной и затем использовали в расчётах констант инактивации. Величину находили, как среднее из 5 – 6 определений (табл.2).

Таблица 2.

Кислотная инактивация протеиназы 1 при температуре 500С.